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行業知識

如何使用超濾離心管

發布時間:2019-04-18 05:37   幫助了7820人
摘要:

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蛋白質濃縮和替代緩沖液常用的超濾管,微孔(mwco10kd)常用的micon-ultra-15超濾管。根據靶蛋白的分子量、濃縮前的體積和濃縮的靶體積,還可提供不同尺寸和尺寸的其他類型的mwco超濾管。它可以重復使用。1。選擇合適的超濾管主要考慮分子量和濃度。通常靶蛋白的分子量不應大于靶蛋白分子量的1/3。例如,當靶蛋白的分子量為35kDa時,可以選擇靶蛋白分子量為10kDa的超濾管。如果靶蛋白的分子量約為10kd,則可使用分子量為3kd的超濾管。2。新購買的超濾是干燥的。使用前加入Milliq水。水的體積完全覆蓋在膜上,冰浴或冰箱被預先冷卻幾分鐘。倒出水后,可以加入蛋白質溶液。蛋白質添加量不超過管頂白線。超濾管在加入蛋白質溶液前需要在冰上預先冷卻。三。平衡。質量和重心都應該平衡。注意速度和加速度不要太快,否則會直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心預冷至4度)。膜和旋轉軸的方向根據說明進行調整(對于角向離心機,膜垂直于軸)。在實際應用中,一般的速度開度比手動低,可以延長離心管的使用壽命。4。當濃縮到剩余的1毫升時,取中國產的50μl布拉德福德溶液,加10μl流過,看是否變藍,以判斷UF管是否漏蛋白。如果管道泄漏,重新倒入上層,然后流過新管道開始超濾。為了準確確定管道是否泄漏,用5 mg/ml BSA離心10分鐘,然后將其穿過,大致運行膠水或Bradford,繼續添加剩余的蛋白質溶液以濃縮(在冰上操作以防止蛋白質加熱),直到所有濃縮物都添加完畢。離心過程中應注意是否有蛋白質沉淀,導致堵塞。如果發生沉淀,有必要確定沉淀的具體原因是蛋白質濃度過高還是緩沖液不當。前者可以通過多個超濾管同時超濾來降低濃度,而后者通過改變不同的緩沖液直到沒有蛋白質沉淀。5。前幾步是用來濃縮蛋白質的。如果要更換緩沖液,當總蛋白溶液濃縮到1毫升左右時,輕輕添加一個新的緩沖液(用0.22um超濾膜超濾后),然后連續濃縮到1毫升左右。濃縮液的最終體積取決于所需的蛋白質濃度,通常不超過500 ul,但也要濃縮到200 ul以下。根據每次至少10次的體積濃度計算,1000次以上的3次基本可以達到更換緩沖器的目的。6。提取最終濃縮蛋白的操作在冰上進行。黃色槍頭(200ul)用于提取最終的蛋白質濃縮物。槍頭沿槍頭邊緣輕輕插入。將蛋白溶液輕輕吹勻。注意不要觸摸超濾膜。吸取濃縮液,一次最多吸200 ul,直至耗盡。最后留在管底的濃縮液不需要吸收,否則太困難,可能損壞超濾膜。最后,在無超濾膜的超濾管中加入Milliq水,以防止超濾膜干燥。7。下面是處理和重復使用超濾管的步驟。8。將超濾管中的水倒出來,用Milliq水輕輕沖洗幾次。[如管底有可見蛋白質沉淀,可先加水,再用槍頭吹氣,注意不要碰觸膜,吹氣至沉淀懸浮,再倒出,不要沖自來水。)然后加入0.2 mNaOH溶液,室溫放置20分鐘,平衡超濾。在此期間定量管。離心10分鐘。倒出剩余的NaOH溶液,將管芯浸入Milliq燒杯(1L或2L)中。放置數小時,然后用新水替換,放置數小時,不斷稀釋NaOH濃度。50ml管道和蓋子用自來水沖洗,內壁用Milliq水沖洗。9。取出浸入水中的芯,并將其加入幾乎滿毫升的水中。在50毫升試管中注入毫升水。慢慢地將芯放入50毫升離心管中,排出一些水。然后蓋上蓋子,4度存放,直到下次使用。一般來說,根據上述步驟和注意事項,每根渠道在三到四年內不會受損。


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